熒光顯微鏡：熒光顯微鏡是利用紫外光作為光源照射被檢物體，使其發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀和位置。

熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的吸收、運輸、分布和定位。細胞內(nèi)的某些物質(zhì)，如葉綠素，受紫外線照射后能發(fā)出熒光；有些物質(zhì)本身不能發(fā)出熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色，在紫外線照射下也能發(fā)出熒光。對此類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。

確認

熒光顯微鏡與普通顯微鏡有以下區(qū)別：
1、照明方式通常為落射照明，即光源通過物鏡投射到樣品上；
2、有兩片特殊濾光片，光源前面的一片用于濾除可見光，目鏡與物鏡之間的一片用于濾除紫外線，保護人眼。
熒光顯微鏡也是光學(xué)顯微鏡的一種，主要區(qū)別在于兩者的激發(fā)波長不同。這就決定了熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡在結(jié)構(gòu)和用途上的差異。
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學(xué)的重要工具。它由光源、濾光板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。它是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大觀察標本的熒光圖像。

工作準則

光源
多采用200W超高壓汞燈作為光源。它由石英玻璃制成，中間呈球形，里面充有一定量的水銀。工作時，兩個電極之間放電使汞蒸發(fā)，球內(nèi)壓力迅速升高。當汞全蒸發(fā)時，可達到50至70個標準大氣壓，這個過程一般需要5至15分鐘左右。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使汞分子不斷解離還原時發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)出強烈的紫外線和藍紫色光，足以激發(fā)各種熒光物質(zhì)，因此常用于熒光顯微鏡。
超高壓汞燈也會釋放大量的熱能。因此，燈室必須具有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜過高。
新型超高壓汞燈在使用初期無需高壓即可點燃。使用一段時間后，需要用高壓（15000V左右）啟動。啟動后，維持工作電壓一般為50-60V，工作電流為4A左右。 200W超高壓汞燈每次使用2小時，平均壽命約為200小時。因此，使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效逐漸降低。燈熄滅后，等待其冷卻后再重新啟動。點亮后不要立即關(guān)閉燈泡，以免汞蒸發(fā)不全而損壞電極，一般需要等待15min。由于超高壓汞燈壓力高，紫外線強，燈泡必須放入燈室內(nèi)才能點燃，以免傷眼和爆炸。
超高壓汞燈（100W或200W）的光源電路包括變壓、鎮(zhèn)流器、啟動等幾部分。燈箱上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡燈泡后面安裝有鍍鋁凹面反射鏡，前面安裝有聚光透鏡。

濾色鏡系統(tǒng)
濾色鏡系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要組成部分，由激發(fā)濾光板和壓濾光板組成。濾板的型號、各廠家的名稱往往不統(tǒng)一。濾光板一般以基本色調(diào)來命名，前面的字母代表色調(diào)，后面的字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特征。例如德國產(chǎn)品（肖特）BG12是一種藍色玻璃，B是藍色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母；有一些廠家的濾板全用數(shù)字命名，如美國康寧廠的濾板。 NO：5-58，相當于BG12。

1.激發(fā)濾光板根據(jù)光源和熒光顏料的特性，可以選擇以下三種類型的激發(fā)濾光板，以提供一定波長范圍內(nèi)的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾光片：該濾光片可透過400nm以下的紫外光，阻擋400nm以上的可見光通過。常用的型號有UG-1或UG-5，再加一個BG-38來消除紅色尾流。
紫外藍光激發(fā)濾光板：該濾光板可以通過300-450nm范圍內(nèi)的光。常用型號有ZB-2或ZB-3，加上BG-38。
紫藍色激發(fā)濾光片：可通過350～490nm的光。常用型號為QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上的熒光素（如羅丹明色素）可以被藍綠色濾光板（如B-7）激發(fā)。
使用金屬膜干涉濾光片。由于其針對性強、波長合適，激發(fā)效果比玻璃濾光片更好。例如西德Leitz工廠的FITC專用KP490濾板和羅丹明的S546綠色濾板都遠遠優(yōu)于玻璃濾板。
激勵濾光片分為薄型和厚型兩種。一般暗視野使用較薄的濾光板，明視場熒光顯微鏡可使用較厚的濾光板。基本要求是獲得最亮的熒光和好的背景。

2、壓制濾光板 壓制濾光板的作用是全阻擋激發(fā)光的通過，并提供相應(yīng)波長范圍內(nèi)的熒光。與激發(fā)濾光板相對應(yīng)，常用的有以下三種壓制濾光板：
紫外光壓制濾光板：可透過可見光，阻擋紫外線透過。可與 UG-1 或 UG-5 結(jié)合使用。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍壓濾板：可通過波長510nm以上（綠至紅）的光，可與BG-12組合使用。通常使用OG-4K510或OG-1K530。
紫外壓制濾光板：可透過波長460nm以上（藍到紅）的光，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490、K510。

反光罩
反光罩的反射層一般采用鍍鋁，因為鋁在紫外光和可見光的藍紫光區(qū)吸收較少，反射率在90%以上，而銀的反射率只有70%；一般采用平面反射器。

專
為熒光顯微鏡設(shè)計的聚光鏡由石英玻璃或其他傳輸紫外線的玻璃制成。有光場聚光鏡和暗場聚光鏡兩種。還有相襯熒光聚光器。
1. 明場聚光鏡 明場聚光鏡常用于一般熒光顯微鏡。聚光能力強，使用方便。特別適合低倍和中倍放大標本的觀察。
2. 暗視野聚光鏡 暗視野聚光鏡越來越多地用于熒光顯微鏡。因為激發(fā)光不直接進入物鏡，除了散射光外，激發(fā)光不進入目鏡?？梢允褂帽〉募ぐl(fā)濾光片來增強激發(fā)光的強度，并且壓濾光片也可以很薄。無色濾光片（無紫外線透射），同時仍產(chǎn)生深色背景。從而增強了熒光圖像的亮度和對比度，提高了圖像質(zhì)量，觀察舒適，并且可以發(fā)現(xiàn)明場中難以區(qū)分的細小熒光顆粒。
3、相襯熒光聚光鏡 相襯聚光鏡與相襯物鏡配合使用，可以同時進行相襯和熒光相結(jié)合的觀察，既可以看到熒光圖像，又可以看到相襯圖像。有助于熒光的準確定位。一般熒光觀察很少需要這種聚光鏡。

物鏡
可以使用多種物鏡，但優(yōu)選消色差物鏡，因為它的自發(fā)熒光最小，并且其透射率（波長范圍）適合熒光。由于顯微鏡視場內(nèi)圖像的熒光亮度與物鏡孔徑比的平方成正比，與其放大倍數(shù)成反比，因此為了提高熒光圖像的亮度，需要采用大孔徑的物鏡。應(yīng)使用孔徑比。尤其是在高倍放大下，其效果非常明顯。因此，對于熒光不足的標本，應(yīng)使用大孔徑比的物鏡，目鏡盡可能低（4×、5×、6.3×等）。

目鏡
在熒光顯微鏡中使用低倍目鏡，例如 5× 和 6.3×。過去經(jīng)常使用單目目鏡，因為其亮度是雙目目鏡的兩倍以上，但研究型熒光顯微鏡大多使用雙目目鏡，觀察非常方便。
落射光裝置
新型落射光器件是光源發(fā)出的光照射到干涉分光濾光片后，由于濾光片上涂層的性質(zhì)，短波長部分（紫外線和紫藍色）被反射。當濾光片面向光源時，為45度。傾斜時垂直射向物鏡，然后通過物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，物鏡直接起聚光作用。同時，濾光片的長部分（綠色、黃色、紅色等）對于濾光片來說是透明的。因此，它不會反射向物鏡，并且濾光片充當激發(fā)濾光片。由于標本的熒光處于可見光波長范圍內(nèi)，可以通過濾光片到達目鏡進行觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)的增加而增加，并且在高放大倍數(shù)下比透射光源更強。除具有透射光源的功能外，更適合直接觀察不透明和半透明標本，如厚片、濾光片、菌落、組織培養(yǎng)標本等。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為落射熒光顯微鏡。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為落射熒光顯微鏡。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為落射熒光顯微鏡。

CCD

簡介
熒光顯微鏡CCD是與熒光顯微鏡密切相關(guān)的數(shù)碼相機產(chǎn)品。一方面可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產(chǎn)物通過USB接口傳輸至計算機，方便圖像采集和研究。另一方面，通過熒光顯微鏡CCD我們可以比單獨使用熒光顯微鏡拍攝更好的照片。熒光顯微鏡CCD可與熒光顯微鏡連接構(gòu)成顯微成像系統(tǒng)。

使用范圍
一般情況下，單獨使用熒光顯微鏡就可以達到理想的成像效果，但在某些情況下，比如當熒光比較弱時，單獨使用熒光顯微鏡無法達到理想的拍攝效果，或者我們希望您可以上傳拍攝的照片熒光圖像傳輸至計算機，用于預(yù)覽、修改甚至發(fā)表學(xué)術(shù)論文。這時如果沒有熒光顯微鏡CCD就無法滿足要求。

特點
熒光顯微鏡CCD一般具有良好的弱光捕獲能力，可以捕獲極弱的熒光，因此成像能力良好。另外，不少熒光冷CCD生產(chǎn)公司都對CCD進行了這樣的制冷處理，使得該類CCD的噪聲大大增加。減少，信噪比可以大大提高。由于其方便的應(yīng)用效果，此類CCD相機廣泛應(yīng)用于熒光顯微鏡中。

標本制備要求

熒光顯微鏡的標本制備要求
1. 載玻片
載玻片的厚度應(yīng)在 0.8 至 1.2 毫米之間。一方面，如果坡度太厚，會吸收更多的光，另一方面，激發(fā)光不能集中在標本上。載玻片必須光滑、厚度均勻且無明顯自發(fā)熒光。有時使用石英玻璃載玻片。

2、蓋玻片
蓋玻片厚度約為0.17mm，光滑、潔凈。為了加強激發(fā)光，還可以使用干涉蓋玻片，它是一種特殊的蓋玻片，上面鍍有幾層物質(zhì)（如氟化鎂），這些物質(zhì)對不同波長的光有不同的干涉效果。平滑地通過，同時反射激發(fā)光，該反射的激發(fā)光可以激發(fā)樣本。

3、標本
組織切片或其他標本不宜太厚，太厚則大部分激發(fā)光消耗在標本下部，物鏡直接觀察的上部激發(fā)不夠充分。另外，細胞的重疊或雜質(zhì)的掩蔽也會影響判斷。

4.封固劑
甘油是常用的封固劑。它必須是無色透明且無自發(fā)熒光的。 pH值8.5~9.5時熒光亮度較亮，且不易快速消失。

5、鏡油
一般用暗場熒光顯微鏡和油鏡觀察標本時，必須使用鏡油。最好使用專用的非熒光鏡片油。也可以使用上述的甘油來代替。也可以使用液體石蠟，但折射率較低，圖像質(zhì)量略有影響。影響。

指示

(1)打開光源，超高壓汞燈需要預(yù)熱15分鐘才能達到最亮點。
(2)對于透射型熒光顯微鏡，應(yīng)在光源和暗場聚光鏡之間安裝所需的激發(fā)濾光片，并在物鏡后面安裝相應(yīng)的壓濾光片。對于落射熒光顯微鏡，需要將所需的激發(fā)濾光片、二色分束器和壓濾光片插入件插入光路中的槽中。
(3)用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置調(diào)節(jié)光源中心，使其位于整個照明光斑的中心。
(4) 放置標本片，調(diào)焦后觀察。使用時應(yīng)注意：未安裝濾光片時請勿用眼睛直接觀察，以免造成眼睛損傷；用油鏡觀察標本時，必須使用無熒光的專用鏡油；高壓汞燈關(guān)閉后，不能立即再次打開，需要等待。水銀燈必須全冷卻后才能重新啟動，否則會不穩(wěn)定，影響水銀燈的壽命。
(5)觀察。例如，在熒光顯微鏡下使用藍紫色濾光片，觀察用0.01%吖啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光（深綠色和橙紅色）。

防范措施

(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書的要求進行操作，不得隨意改變程序。
(2)檢查應(yīng)在暗室中進行。進入暗室后，接通電源，點亮超高壓汞燈5-15分鐘。光源發(fā)出的強光穩(wěn)定后，眼睛全適應(yīng)暗室，然后開始觀察標本。
(3)為防止紫外線對眼睛的傷害，調(diào)節(jié)光源時應(yīng)戴防護眼鏡。
(4)檢查時間每次以1～2小時為宜。如果超過90分鐘，超高壓汞燈的發(fā)光強度會逐漸下降，熒光也會減弱；標本經(jīng)紫外線照射3～5分鐘后，熒光也會明顯減弱；因此，不應(yīng)超過2至3小時。
(5)熒光顯微鏡光源的壽命有限，應(yīng)集中檢查標本，以節(jié)省時間并保護光源。天氣炎熱時，應(yīng)加風扇降溫，并從更換新燈泡時開始記錄使用時間。燈泡熄滅后想再次使用時，必須等燈泡冷卻后再點亮。應(yīng)避免每天多次點亮光源。
(6) 染色后立即觀察標本，隨著時間的推移熒光會逐漸減弱。如果將標本保存在4℃的聚乙烯塑料袋中，可以延遲熒光減弱時間，并可以防止封片劑蒸發(fā)。激發(fā)光長期照射標本會引起熒光衰減和消失，因此應(yīng)盡量縮短照射時間。暫時不觀察時可用遮光罩遮擋激發(fā)光。
(7)觀察標本時應(yīng)使用非熒光油，并避免眼睛直視紫外光源。
(8)電源應(yīng)配備穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)定會降低日光燈的壽命。

熒光顯微鏡與普通顯微鏡有以下區(qū)別：
1、照明方式通常為落射照明，即光源通過物鏡投射到樣品上；
2、光源為紫外光，波長較短，分辨率比普通顯微鏡高；
3、有兩片特殊濾光片，光源前面的一片用于濾除可見光，目鏡與物鏡之間的一片用于濾除紫外線，保護人眼。
熒光顯微鏡也是光學(xué)顯微鏡的一種，主要區(qū)別在于兩者的激發(fā)波長不同。這就決定了熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡在結(jié)構(gòu)和用途上的差異。
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學(xué)的重要工具。它由光源、濾光板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。它是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大觀察標本的熒光圖像。