mediomics：Bridge-It PDE檢測試劑盒：Bridge-It® cAMP-磷酸二酯酶 (PDE) 檢測試劑盒，96 孔格式 

Bridge-It® cAMP 磷酸二酯酶 (PDE) 測定是一種基于熒光的高通量篩選 (HTS) 方法，用于測量純化來源的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性并確定其抑制劑的 IC 50。該測定基于 Bridge-It® cAMP 多合一熒光測定（Mediomics，目錄號 122938）的形式。

應(yīng)用：

• PDE相關(guān)藥物發(fā)現(xiàn)項目

• 心、肺（即COPD）、血小板功能和炎癥機制的研究

• 焦慮癥或神經(jīng)退行性疾病的研究

特征：

• 簡單： 將測試樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與測定溶液混合并在 ~25°C 下孵育

• 快速： 孵育 30 分鐘后讀取熒光信號

• 靈活： 檢測方法適用于低通量和高通量篩選形式

cAMP、PDE 和 Bridge-It 熒光測定的背景信息

3',5'-環(huán)單磷酸腺苷 (cAMP)

3',5'-環(huán)單磷酸腺苷 (cAMP) 是重要的第二信使，參與多種生物過程的調(diào)節(jié)。 cAMP 的測量在新藥發(fā)現(xiàn)中尤其重要，因為 cAMP 水平與新藥發(fā)現(xiàn)的主要靶標(biāo)之一——G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 的活性密切相關(guān)。用于測定 cAMP 濃度的 Mediomics 熒光 cAMP 測定方法基于上述測定平臺設(shè)計。 CAP 是一種細菌 DNA 結(jié)合蛋白，其 DNA 結(jié)合活性取決于 cAMP 的存在，被用作測量 cAMP 水平的高度特異性生物傳感器。當(dāng) PDE 將 cAMP 水解為 AMP 時，cAMP 濃度降低，從而導(dǎo)致 CAP-DNA 復(fù)合物形成減少，并與探針形成更多游離“半位點"雙鏈體（未猝滅）。熒光信號的增加與 PDE 活性成正比。

Bridge-It® PDE 檢測 – cAMP 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以下 cAMP 標(biāo)準(zhǔn)曲線代表使用 Bridge-It® PDE 測定法制備的曲線。它顯示了在 384 孔板中的緩沖液 B 中制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在添加 2X 檢測溶液 30 分鐘、1 小時和 2 小時后讀取熒光信號。

Bridge-It® PDE 檢測 – PDE 活性檢測

以下 PDE 活性測定是使用 Bridge-It® PDE 測定制備的代表性測定。相對活性是在含有指示量的牛腦 PDE 的樣品中測量的（Sigma，St. Louis，MO，目錄號 P9529）。將反應(yīng)在室溫下溫育30分鐘并通過添加0.5ul終止溶液來終止。添加 2X 測定溶液，并在室溫下孵育 40 分鐘后讀取信號。

Bridge-It® PDE 測定 – IC 50測定

以下測定是使用 Bridge-It® PDE 測定制備的代表性測定。使用來自牛腦的 0.8 mU PDE（Sigma，St. Louis，MO，Cat# P9529）和一定量的 IBMX（Sigma，St. Louis，MO）測量樣品的相對活性。

注意：RA（相對活性）的定義位于協(xié)議第 8 頁。 PDE 測定在標(biāo)準(zhǔn) 384 孔板中進行，最終 10 ul 反應(yīng)液含有 1 x PDE 反應(yīng)緩沖液（25 mM Tris，pH 7.4，100 mM NaCl，BSA 0.1 mg/ml，CaCl2 0.03 mM，鈣調(diào)蛋白（Sigma， St. Louis, MO, Cat# P1431) 10 U/ml)，含有來自牛腦的 0.8 mU PDE (Sigma, St. Louis, MO, Cat# P9529) 和一定量的 IBMX (Sigma, St. Louis, MO) ）。將酶和 IBMX 混合并在室溫下預(yù)溫育 5 分鐘。添加6 pmole cAMP，并將反應(yīng)在室溫下溫育30分鐘，并通過添加0.5ul終止溶液來終止。添加 2X 測定溶液，并在室溫下孵育 40 分鐘后讀取信號。

研究用途： 僅供研究使用，不可用于診斷程序。

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