β木糖苷酶測(cè)試盒

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細(xì)菌和真菌等生物體，是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guān)鍵酶，產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵。另外，β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應(yīng)用于造紙工業(yè)，比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

測(cè)定原理：

β-木糖苷酶催化對(duì)硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰，測(cè)定405nm光吸收增加速率，可計(jì)算β-木糖苷酶活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心20min，取上清待測(cè)。

細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm。

2. 操作表

β-木糖苷酶活性計(jì)算公式：

1. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=13.226x+0.0011，R2=0.9998；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值ΔA。

1、按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)每毫克蛋白1min內(nèi)催化產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mg prot）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×1000

= 11.34×(ΔA -0.0011)÷ Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)每克樣品1min內(nèi)催化產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/g 鮮重）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T×1000= 11.34×(ΔA-0.0011)÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)每104個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)催化產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/104cell）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷T×1000=11.34×(ΔA-0.0011) ÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)每毫升液體1min內(nèi)催化產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mL）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷V樣÷T×1000

=11.34×(ΔA-0.0011)

V樣總：加入提取液體積，1mL； V反總：反應(yīng)總體積，0.12mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；1000:1μmol/L=1000nmol/L

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=6.613x+0.0011，R2=0.9998；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值ΔA

1、按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)每毫克蛋白1min內(nèi)催化產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mg prot）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×1000

= 22.68×(ΔA -0.0011)÷ Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)每克樣品1min內(nèi)催化產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/g 鮮重）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T×1000= 22.68×(ΔA-0.0011)÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)每104個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)催化產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/104cell）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷T×1000=22.68×(ΔA-0.0011) ÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)每毫升液體1min內(nèi)催化產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mL）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷V樣÷T×1000

=22.68×(ΔA-0.0011)

V樣總：加入提取液體積，1mL； V反總：反應(yīng)總體積，0.12mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；1000:1μmol/mL=1000nmol/mL

ΔA控制在0.01-1范圍內(nèi)，若ΔA大于1，可適當(dāng)減小樣本量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.01μmol/mL-0.5μmol/mL。

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