Fluoro-Gold

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美國 Fluorochorome 公司于1985 年成立于美國科羅拉多州丹佛市，Fluorochorome 一直 致力于熒光染料的研究與開發(fā)，其產品Fluoro Gold（熒光金）自 1985 年來在全球范圍 內被廣泛應用，并有大量的參考文獻。同時，F(xiàn)luorochrome公司特別開發(fā)了高靈敏度的 Fluoro-Gold Antibody 、以及 Fluoro-Ruby（紅色熒光金）等產品，F(xiàn)luorochrome 公司堅 持以優(yōu)質的產品和熱情的服務贏得了良好的口碑。

小鼠右頸髓 DAPI染色縱切面的顯微照片，展示了典型的熒光金標記運動神經元柱。圖片最初發(fā)表于Tosolini AP、Mohan R、MorrisR(2018)。以小鼠前肢運動終板區(qū)域的全長為目標可增加熒光金進入相應脊髓運動神經元的吸收。Front.Neurol. 4:58, 1-10,4

大鼠前肢中強陽性熒光金標記的運動神經元。圖片最初發(fā)表于 TosoliniAP,Mohan R(2012)。大鼠前肢運動神經元柱的空間特征。神經科學200:19-30,22.

成年小鼠腰椎脊髓的顯微照片，顯示了用 DAPI復染的熒光金標記的典型柱狀圖。圖片最初發(fā)表于 MohanR, Tosolini AP, Morris, R.(2014)。神經科學 274:318-330,323

1.背景

熒光金的使用方法與其他熒光示蹤劑基本相同，但在注射后存活時間、濃度范圍、組織處理以及與其他組織化學技術的兼容性方面，熒光金更為靈活。

2.儲存和保質期

干熒光金應存放在4 攝氏度的避光密閉容器中。妥善儲存后，熒光金的保質期應超過一年。溶液中的染料也應存放在4 攝氏度的避光密閉容器中，并應保持穩(wěn)定至少六個月。

8.載體

Fluoro-Gold 可溶于蒸餾水或 0.9%鹽水。Fluoro-Gold 在堿性 pH 下不溶解。但它也可以用作0.2M 中性磷酸鹽緩沖液中的懸浮液。

4.染料濃度

氟金已成功應用于濃度范圍為 1-10%的染料。最初建議使用 4%的濃度。如果注射部位發(fā)生不良壞死，或標記太強烈，請將濃度降低至 2%溶液。如果您需要使用更精確的測量方法，氟金的分子量為532.6 道爾頓。

5.染料管理

·A.壓力注射 -這可能是常用的應用模式。注射量范圍為 0.05-1 μl，通常為 0.1-0.2 ml。

B.離子電滲療法 --通過 4-10 秒脈沖離子電滲療法(+5 至 +10ua/10 分鐘)應用，可產生離散、小注射部位。

C.晶體-示蹤劑晶體可以通過微量移液器的頭端注入。

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6.術后存活期

觀察到良好的逆行標記，存活期從兩天到兩個月不等。存活期通常為三到五天。較長的存活期可增強遠端突起的填充，而不會使染料從細胞中擴散。

7.固定

幾平任何固定劑都可以使用，也可以不用固定劑，通常使用含4%用醛的磷酸鹽中性緩沖鹽水。含有高濃度重金屬(如鋨、示)的固定劑會淬滅熒光，而高濃度(超過1%)的戊二醛可能會增加背景熒光

8.組織化學處理

含有熒光金的組織幾乎可以根據(jù)任何常見的組織學技術進行處理。這包括未固定組織的低溫切片(10mm)、固定組織的冷凍切片(20um)以及從嵌入塑料(0.2-4 mm)或石蠟(3-10 mm)的組織中切下的薄切片。固定組織的冷凍切片*常用。

9.組合方法

在此處理階段，可對切片進行進一步處理以獲得第二種標記物，例如放射自顯影、HRP組織化學、免疫細胞化學、第二種熒光示蹤劑、熒光復染劑等。

10.封片、透明化和蓋玻片

切片通常封片在明膠包被的載玻片上，風干，浸入二甲苯中，并用無熒光 DPX塑料封片劑蓋玻片。切片可用分級酒精脫水，除非這與第二種示蹤劑不兼容。如果要將 Fluoro-Gold 與熒光免疫細胞化學相結合，則切片要風干，并用中性緩沖中甘油(1:2)直接蓋玻片。

11.檢查和攝影

熒光金可使用帶寬帶紫外線激發(fā)濾光片的熒光顯微鏡進行可視化。當用中性 pH 緩沖液處理組織時，會發(fā)出金色，而當用酸性(例如pH 3.3)pH 緩沖液處理組織時，會發(fā)出藍色。可以用數(shù)碼或膠片拍攝(彩色照片使用 Ektachrome 200-400 ASA膠片，黑白照片使用速度相當?shù)哪z片，例如 Tri-X)。大多數(shù)曝光時間范圍為 10-60 秒，具體取決干物鏡放大倍數(shù)和標記強度。三十 (80)秒曝光時間約為平均值。可以利用多次曝光同時可視化熒光金和另一種示蹤劑。因此，紫外線與明場照明相結合，可在放射自顯影中同時定位熒光金與 HRP或銀顆粒。同樣，藍光激發(fā)也可結合使用，以品現(xiàn) FITC,的綠色發(fā)射顏色，而綠色激發(fā)光可用于同時觀察碘化丙啶或溴化乙錠(熒光復染劑)的紅色發(fā)射顏色。

載體

對于通過微量注射器或微量移液器進行壓力注射，應將氟金溶解在蒸餾水或 0.9%鹽水中。氟金也可用作 0.2M 中性磷酸鹽緩沖液中的懸浮液，但懸浮顆粒可能會堵塞細小的微量移液器頭端，因此蒸餾水或 0.9%鹽水是載體。對于離子電滲療法，在 0.1M 醋酸鹽緩沖液(pH=3.3)中配制 1% 氟金溶液。清潔干凈的(95%乙醇、水)玻璃微量移液器頭端應為 10-20 mm。最佳離子電滲療法參數(shù)為+1 至 +5u 安培，脈沖電流(開啟 4-10 秒，關閉 4-10 秒)持續(xù) 10-20 分鐘。

注射部位

幾乎任何中樞或周圍神經系統(tǒng)結構都可以注射熒光金，以分析逆向運輸。在周圍神經系統(tǒng)中，可以研究神經節(jié)和周圍靶標。對于周圍神經的研究，應切斷或損壞神經，然后將其浸入或注射5%的熒光金溶液中。由于完整的通道纖維不能大量吸收熒光金，因此必須切斷或嚴重損壞纖維才能吸收染料。

運輸和生存時間

熒光金被用作逆向軸突示蹤劑，盡管確實存在順向軸突運輸。存活時間應該有所不同(尤其是 12 小時-2 天的非常短的存活時間)，以最大限度地提高所研究的特定神經系統(tǒng)中的順向運輸。對干逆向運輸，存活時間應該從 4天到 14 天不等。7到 10 天適用于大多數(shù)系統(tǒng)，盡管長通路(例如脊髓到腦干)和大型哺乳動物(例如貓、猴子)的通路可能需要更長的存活時間(例如 14 天)。此外，由于熒光金在逆向標記的神經元內保持快速，因此數(shù)月的存活時間也會產生優(yōu)異的效果。對于離子電滲療法，建議存活時間為 2-5天。據(jù)估計，哺乳動物每天的運輸速度約為2厘米;對于冷血動物來說，它的速度比較慢。

組織處理

組織處理在使用指南和原始出版物中有詳細介紹(Schmued and Fallon，1986，Brain Research 877:147-154)。由于熒光金在許多溶劑中都很穩(wěn)定，并且在逆向標記的神經元中保持穩(wěn)定，因此它的使用與許多組織化學技術兼容。它可以與其他逆向示蹤劑、免疫熒光、PAP 和 ABC免疫細胞化學、HRP組織化學、放射自顯影、復染(溴化乙錠是*選的熒光復染)、石蠟包埋和塑料包埋一起使用。但是，如果組織未固定，在水溶液中對組織進行額外處理超過一兩個小時將導致標記神經元的熒光金熒光消失。熒光金可能在電子顯微鏡中有用。熒光金可用于已切片并轉移到磷酸鹽緩沖液的大腦。切片通常安裝在明膠包被的載玻片上，風干，浸入二甲苯中，并用 DPX塑料封片劑蓋上(FLUKA Chemical Corp.,255 Oser Avenue，Hauppauge，NewYork，11788，目錄號44581)。組織也可以在載玻片上觀察而無需進一步處理，可以通過分級酒精進行脫水，或者，對于免疫細胞化學，可以將切片風干并直接用中性緩沖中甘油(1:2)蓋上。

檢查和攝影使用寬帶紫外線(UV)激發(fā)濾光片，在熒光顯微鏡下觀察熒光金。使用與在寬帶紫外線下激發(fā)的其他熒光逆行示蹤劑相同的濾光片組(例如，真藍、快藍、核黃)，例如 Leitz Ploem 濾光片系統(tǒng) A(寬帶紫外線、激發(fā)濾光片 BP 340-380)、鏡面 RKP 400、屏障濾光片 1P430)。應專門為熒光顯微鏡制作物鏡(例如蔡司制造的物鏡)、甘油或水。由于塑料會吸收紫外線，因此不建議通過塑料培養(yǎng)皿等觀察。推薦的膠片是 T-Max(柯達，黑白)和 Ektachrome 200(柯達，彩色幻燈片)。曝光時間通常為 20 秒到 1.5分鐘。

Fluoro-Gold (Fluorogold)是 Fluorochrome,LLC 的*家產品。它由 Fluorochrome 銷售，自1985 年以來被廣泛使用。其他公司正在銷色他們聲稱與Fluoro-Gold 相同或等同的產品。這些化合物的化學結構與Fluoro-Gold 不同，并且這些化合物的某些物理性質可能非常不同。

“注意:熒光金、熒光金抗體和熒光紅寶石僅供安驗室研光動物或體外試驗研究使用。不可用于人體。這些藥物應僅供定期從事神經解部學研充和體外試驗或僅用于安驗室研充的動物的人員使用。

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