含紅色染料的 RedMasterMix （2x） Taq PCR MasterMix  產(chǎn)品編號： M3029.0100

優(yōu)勢一覽

• 輕松跟蹤移液步驟

• 穩(wěn)健的性能 – 高度穩(wěn)定的 PCR 預混液

• 菌落篩選 – 針對快速篩選進行了優(yōu)化

• 無需額外步驟 – 已包含上樣緩沖液

• 方便的規(guī)格 – 1.5 mL 等分試樣大小，易于作

規(guī)格：
用于 PCR 的 2 次即用型預混液，包括用于更好地觀察移液的紅色染料和凝膠上樣染料。已包括 dNTP、緩沖液和 DNA 聚合酶。

方便的等分試樣大?。?.25 mL。該預混液在 +2°C 至 +8°C 下可穩(wěn)定保存至少 8 個月。

用于小鼠尾巴的可靠 PCR。用于 Sanger 測序反應。

One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 1 mM b-mercaptoethanol; and activated calf thymus DNA as substrate.

synthetic

Sicherheits Hinweise / Safety

Klassifizierungen / Classification

eclass-Nr: 32-16-05-02

技巧

對于每個模板/引物對，必須憑經(jīng)驗評估最佳反應條件，例如通過改變引物與模板的比例或離子強度（使用 MgSO4）和循環(huán)參數(shù)（時間和溫度）。

DNA 模板

• GENAXXON Red 預混液特別適用于不太干凈的鼠尾 DNA

• 關于 10E4需要靶 DNA 的拷貝才能在 25-30 個循環(huán)后獲得可檢測的產(chǎn)物。

• 使用 1pg–1ng 質粒 DNA 或病毒 DNA。

• 使用 1ng–1 μg 用于基因組 DNA。

• 較高的 DNA 濃度會降低擴增子特異性，并導致額外的條帶，尤其是當使用大量循環(huán)時。

• 如果需要較少的循環(huán)次數(shù)，例如為了提高特異性，可以使用更高的 DNA 濃度。

底漆

• 一般來說，這些應該有 20-30 個核苷酸的長度。

• 理想的 GC 含量為 40-60%。

• GC 堿基應盡可能均勻地分布在引物上。

• 引物對的兩種引物的熔解溫度相差不應超過 5°C。

• 避免引物內(nèi)的二級結構（例如發(fā)夾）以及所用引物對之間潛在的二聚化區(qū)域。

• 如果將轉基因位點（側面定向誘變）摻入引物中，那么最好在距離側面定向誘變位點 5' 處插入 4-6 個額外的堿基，以便引物可以在正確的位置退火。

• 每種引物的最終濃度應在 0.05-1 μM 之間（0.05 μM 是下限），典型值在 0.1 至 0.5 μM 之間。

• 較高的濃度會導致引物二聚化增加，并“產(chǎn)生"或模擬假擴增產(chǎn)物。

• 在引物和探針的情況下，可以假設隨著引物量的增加，PCR 一開始當然也會運行得更好（通常一開始會預期 Ct 值會更早）。然而，隨著濃度的持續(xù)增加，PCR 達到飽和。除了略低的 Ct 值外，熒光信號通常也在開始時以較高的引物/探針濃度被放大。

• 此外，可以添加一個或多個探針（應始終充分測試必要的濃度）。我們建議在 50-500 nM 之間。在這方面，應測試不同的組合。

鎂濃度

• 1.5-2.0 mM Mg2 + 是 Taq DNA 聚合酶作用的選擇，但最佳 Mg2 + 濃度在很大程度上取決于模板、緩沖液組成、DNA 量以及 dNTP，因為后兩者尤其具有螯合鎂的高傾向，從而將其從 PCR 反應中吸收。

• 如果 [Mg2+] 太低：不可見 PCR 產(chǎn)物。

• 如果 [Mg2+] 過高：可以看到不需要/不正確的 PCR 產(chǎn)物?？赡苤荒芸吹酵科?/span>

脫氧核苷酸 （dNTPs >）

• 典型濃度為 200 μM 每個單獨的 dNTP。然而，原則上，200-400 μM 的 dNTP 是 PCR 的良好濃度。

• 50-100 μM 的較低濃度會增加特異性，但在某些情況下會顯著降低產(chǎn)量。

• 較高的濃度會增加產(chǎn)量，尤其是對于長擴增子，但會顯著降低特異性。

DNA 聚合酶

• 選擇正確的聚合酶取決于預期用途和所使用的模板（標準 PCR：高準確度的 Taq DNA 聚合酶 S >，高產(chǎn)量的 Taq 聚合酶 E >;預混液：標準 PCR MasterMix > 或 Red MasterMix >含紅色染料）。

• 對于多重 PCR，有特殊的凍干多重 MasterMixe >。

• 為了提高特異性或對于困難的模板，建議使用熱啟動應用程序。為此，>有特殊的熱啟動聚合酶。

• 對于用于克隆或其他需要低錯誤率的方法的 PCR，熱穩(wěn)定的高保真校正聚合酶，如
  Pfunds >、ExactRun >、ReproFast > 或 ReproHot （KOD） 校正聚合酶>。這些酶在擴增過程中的錯誤要少得多，并增加了無錯誤擴增子的機會。

• 對于基因分型和其他需要高鑒別度的應用，有一種新型高選擇性 DNA 聚合酶 SNP Pol DNA 聚合酶 >。它特異性地區(qū)分錯配的引物模板復合物，并特異性地僅提供具有*全匹配引物對的 PCR 產(chǎn)物。

• 對于實時定量 PCR >，有高度專業(yè)化的 qPCR 預混液。在這里，選擇合適的預混液取決于所使用的 qPCR 設備。例如，重要的是要注意 qPCR 預混液中是否應包含 ROX 以及應包含多少 ROX，以及它是帶有綠色熒光染料>的 Green qPCR Mastermix 還是不含熒光染料的 Probe qPCR MasterMix >。也可提供在室溫下穩(wěn)定的微珠凍干 （LyoBalls >）。

• PCR 反應中使用的 DNA 聚合酶量會顯著影響 PCR 結果（對于 50 μL 方法，使用 1.25 - 1.5 單位 Taq 聚合酶>）。

退火

• 退火溫度應通過溫度梯度進行優(yōu)化。退火期也會影響成功。確實，使用不同的預混液或使用其他供應商的反應緩沖液會對退火溫度產(chǎn)生嚴重影響。

• 引物對的兩種引物的熔解溫度相差不應超過 5°C。

• 典型的退火溫度比所用引物的*低 Tm 低約 5°C。溫度通常下降到 50-60°C 之間。

• 如果存在非特異性條帶或潤滑，則應測試更高的退火溫度。

• 典型的退火時間在 15-30 秒范圍內(nèi)。

延伸溫度和時間

• 擴增子延伸通常在 68°C 下進行。

• 作為一般規(guī)則，可以假設每 1000 個堿基對的標準 Taq 聚合酶在 68°C 下的延伸時間為 1 分鐘（或 2000 個堿基對為 2 分鐘，或 3000 個堿基對為 3 分鐘）。

• 對于小于 1 kb 的 PCR 產(chǎn)物，可以采取 45-60 秒（如果不是接近 1 kb 的擴增子，則更像是 45 秒）。

• 超過 3000 個堿基對的 PCR 產(chǎn)物和超過 30 個循環(huán)的 PCR 方案都可能需要更長的延伸時間。因此，應再次優(yōu)化更長的擴增子或更高的循環(huán)數(shù)。

擴增具有高 GC 含量、強二級結構、低濃度或大于 5 kb 的擴增子的模板通常需要優(yōu)化 PCR 條件。通常，在 PCR 過程中應在 95°C 下進行 15-30 秒的變性。

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含紅色染料的 RedMasterMix （2x） Taq PCR MasterMix